Considerada como una joya arquitectónica del siglo XVI, la Iglesia Nuestra Señora de Guápulo es el primer Santuario Mariano del Ecuador, que rinde culto a la Virgen de Guadalupe, de la cual existe una imagen, tallada por el artista Diego de Robles y policromada por el pintor Luis de Rivera.
Diseñada por el arquitecto franciscano Antonio Rodríguez. Su construcción inició en 1649 durante la época Colonial. Su fachada conjuga un estilo neoclásico sencillo y el templo principal es de una sola nave, con forma de planta de cruz latina, con una gran cúpula central.
El púlpito de la Iglesia de Guápulo es único en su estilo y forma, por lo que es considerado entre los más hermosos de Latinoamérica, es una obra maestra del escultor indígena Juan Bautista Menacho.
La sacristía fue habilitada como museo en el 2001, compuesto por tres salas donde se exhiben obras de varios artistas de la Escuela Quiteña como: Caspicara, Samaniego, Miguel de Santiago, entre otros.
Para llegar a la iglesia de Guápulo se tiene que recorrer una vía que fue utilizada por Francisco de Orellana en 1542 como ruta que le llevó a descubrir el río Amazonas, conocida como el Camino de los Conquistadores.